Cell viability (세포 생존율) 측정 방법 - MTT assay 실험 방법으로 확인 해 봅시다.

MTT assay 의 원리

  MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 는 정상적으로 살아있는 혹은 증식하는 세포(대사과정이 온전한 세포)에서는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의해 수용성의 노란색 MTT 를 비수용성의 MTT formazan (자주색)으로 환원시키게 됩니다.

  비수용성인 MTT foramazan을 DMSO 또는 DMF 에 용해시켜 흡광도를 측정할때 파장은 540 nm이며, 측정된 흡광도가 높을 수록 살아있고 대사적으로 왕성한 세포임을 나타냅니다.

  장점 : 1) sensitive, 2) accurate, 3) safety, 4) easy & rapid, 5) semiautomatic 등이 있습니다.

eurofins 홈페이지 발췌 (https://www.eurofins.de/medizinprodukte-pruefungen/validierte-methoden/mtt-test/)

 

※ 1. MTT 시약은 부착세포에만 사용할 수 있는 반면에,

       동일한 원리지만 부유세포에도 사용할 수 있는 MTS, XTT 시약을 사용하기도 합니다.

    2. 최근에는 더 민감하고 반복해서 사용할 수 있는 CCK8 assay 를 더 많이 사용하는 추세입니다.

        (위의 두가지 방법은 추후에 다시 소개해 드리겠습니다.)

 

 

MTT 실험시 가장 주의해야 할 점!

1) Cell seeding

   - 배양 용기에 고르게 seeding하지 않으면 group별 MTT 흡광도의 오차가 커짐.

      ==>  1. cell pellet 상태에서 완전하게 single cell로 만들어 줌.

              2. 배양 용기에 따른 적정 cell 수를 seeding 함.

   ※ 아래 예시는 Hela, A549 등 cancer cell line 기준이며, 세포의 크기/성장속도에 따라 다르다.

     (48hr 이후 harvest)  6 well - 1 X 10^5 ~ 2 X 10^5 cells / well 

                                    12 well - 5 X 10^4 ~ 1 X 10^5 cells / well

                                    24 well - 4 X 10^4 ~ 5 X 10^4 cells / well

                                    48 well - 2 X 10^4 ~ 4 X 10^4 cells / well

                                    96 well - 5 X 10^3 ~ 1 X 10^4 cells / well

              

2) Culture Media 제거

   - Chemical drug 또는 virus 등을 세포에 treatment 한 후 media chang 가 필요한 경우나

      MTT 넣은 후에 4시간이 지난후 soup 제거시 plate 바닥에 붙어있는 cell까지 딸려 나오지 않게 제거함.

      ==> 1000 ml pipetteman을 사용하고 어느정도 남았을때 200 pipetteman 을 사용하여 제거한다.

  ※ 가능한 빠른시간내에 기존 media 를 제거하고 media 를 추가해야 함. 

    (빠른 시간내 제거가 불가능 할 것 같거나 불가능 한 경우에는 suction 을 이용하되 완전히 제거하지 않음) 

 

MTT 시약 제조

MTT in PBS (2 ~ 4 mg/ml) 되게 만들면 된다.

==> 예를들어 MTT 200 ml을 만들고자 할때는 2 mg/ml → 400 mg/200ml = 0.4 g을 200 ml의 1X PBS에 녹임.

    물론 차광된 상태에서 충분히 stirrering 시킨 후 차광된 용기에 syringe를 이용하여 filter 한후 4℃ 보관함.

 

MTT  assay procedure

1) 6~96 well plates에 일정량 cell seeding.

   - Seeding 하는 cell의 개수은 자신이 실험하고자 하는 목적에 맞춰서 적당량 seeding 해야 함.

    ※  날짜별 MTT를 할때는 cell이 overgrowth 되지 않게

         혹은 virus 및 chemical의 농도에 의한 세포 살상력 고려함.

 

2) 각각의 분주된 세포를 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 또는 over/night 배양

 

3) 처리하고자 하는 물질을 농도별 처리.

 

4) 37℃, 5% CO2 incubator에서 목적하고자 하는 Time까지 (12~96hr) 배양

 

5) Time이 되었을때 MTT 처리 : Media 에 추가 하거나 PBS 로 chang 후 추가

    (ⅰ) 2 ㎎/㎖ stock → final conc. 100~200 ug/ml 로 첨가.

           ==> 20~40 ㎕/well 씩 첨가 (200ul Media or PBS in 96 well 의 경우)

    (ⅱ) 4hr incubation at 37℃ incubator

     ※ 주의！ MTT 경우 light sensitive하므로 dark 상태에서 실시

 

6) Centrifuge at 500g×5min (plate 째 돌린다.)

   - 이 과정은 필히 할 필요는 없고 바닥에 붙어있는 cell이 떨어지려고 하면 꼭 실시!

 

7) 바닥에 있는 formazan 결정이 제거되지 않도록 주의하면서 pipet을 이용하여 상등액 제거

    - 바닥에 붙은 cell들이 딸려 제거되지 않게 조심!

    - 한번에 털어버리는 방법도 있으나, attach 가 약한 세포주는 지양할 것!

 

8) DMSO 첨가 (well의 media vol. 의 20 ~ 50 %, 100ul in 96well )

   - Soup이 제거된 well에 생성된 fomazan 결정을 용해시키기 위해서..

 

9) 37℃에서 15min방치 또는 pipetting 으로 완전히 용해시킴.

 

10) plate reader 가 모든 종류의 well plate 를 측정할 수 있으면, 바로 540nm 에서 흡광도 측정.

    ==> 그렇지 않고 96 well plate 만 가능한 경우는 100~ 200 ㎕를 96 well에 옮겨서 측정함.

 

MTT를 이용한 생존률 계산법

 

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즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!