RT-PCR (Revers Transcription PCR) 실험 방법 정리

RT-PCR (Revers Transcription PCR) 이란?

생물학적 샘플 (세균, 세포, 조직, 바이러스 등) 에서  특정 RNA 분자를 검출하고 정량화하는 데 널리 사용되는 실험실 기법입니다. RNA 분자가 역전사라는 과정(역전사 효소를 사용하여)을 통해 상보적 DNA(cDNA)로 합성되고결과물인 cDNA는 원본 RNA 분자의 안정적인 사본 역할을 하며 검출을 위해 쉽게 증폭할 수 있습니다.

Chegg 홈페이지 발췌

다음과 같은실험에 응용할 수 있습니다.

 

1. 특정 단백질의 RNA 수준 (mRNA; transcription) 에서의 발현량 확인

2. 특정 단백질을 암호화하고 있는 gene 또는 mRNA 의 분리

3. 특정 시료를 처리한 후 특정 단백질의 mRNA 수준에서의 발현량  비교 등

 

원리는 옆 그림을 참조하세요.

 

 

1. Preparation of RT-PCR

- Revers Transcription System (Promega #A3500 100 reactions)

- mRNA or total RNA (RNA purification) 1-2ug

- RNA 전용 non-autoclaved yellow tip, E-tube 등등

 

2. RT (Reverse Transcription)

- 반응액 조성

 

10X RT buffer	2ul
MgCl2 (25mM)	4ul
dNTP (10mM)	2ul
Oligo (dT)15 or Random primer	0.5ug(1ul)
RNase inhibitor	0.5ul
RTase	15U(0.75ul)
mRNA or total RNA	1-2ug
DEPC H2O or RNase free D.W	add to total vol.
total	20ul

- 반응온도 및 시간

42℃에서 15min 후 99℃ 5min. (30-60min까지 반응시간을 늘려도 상관없음)

20ul cDNA (반응액)을 2-5ul 씩 PCR에 사용해도 괜찮지만

DEPC H2O를 80ul 첨가하여 total 100ul에서 10-20ul씩 사용하기를 권장함.

 

3. PCR

- 반응액 조성

 

	200ul tube	500ul tube
10X buffer	5ul	10ul
MgCl2 (25mM)**	2ul	4ul
dNTP (2.5mM)	2ul	4ul
primer 5' (25pmole)	1ul	2ul
3' (25pmole)	1ul	2ul
Taq polymerase	1-2.5U	2.5U
cDNA	10-20ul	10-20ul
D.W (fitered)	add to total vol.	add to total vol.
total	50ul	100ul

** MgCl2 는 10X buffer 에 포함되어 있는 경우에는 첨가하지 않는다.

 

- 반응조건

pre-heating temp	95℃	5min	30-35  cycles
denaturation temp.	95℃	30-60sec
primer annealing temp.	50-65℃	30-60sec
primer Extension temp.	72℃	30-90sec
final extension temp.	72℃	10min
hold temp.	4℃

 

** primer annealing temp. 설정

Primer 길이와 GC 함량에 따라 결정된다.

GC 개수 primer 길이	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
16	39	41	43	45	47	49	51	53	55	57	59
17	43	45	47	49	51	53	55	57	59	61	63	65
18	45	47	49	51	53	55	57	59	61	63	65	67	69
19	47	49	51	53	55	57	59	61	63	65	67	69	71
20	49	51	53	55	57	59	61	63	65	67	69	71	73
21	51	53	55	57	59	61	63	65	67	69	71	73	75
22	53	55	57	59	61	63	65	67	69	71	73	75	77
23	55	57	59	61	63	65	67	69	71	73	75	77	79
24	57	59	61	63	65	67	69	71	73	75	77	79	81
25	59	61	63	65	67	69	71	73	75	77	79	81	83
26	61	63	65	67	69	71	73	75	77	79	81	83	85
27	63	65	67	69	71	73	75	77	79	81	83	85	87
28	65	67	69	71	73	75	77	79	81	83	85	87	89
29	67	69	71	73	75	77	79	81	83	85	87	89	91
30	69	71	73	75	77	79	81	83	85	87	89	91	93