내피세포(Endothelial Cell) 배양이 어렵나요? 참고해 보세요 ^^ "내피세포 배양 방법 핵심 정리"

내피세포 (Endothelial Cell) 란?

- 혈관 및 림프관의 내벽을 덮고 있는 단층의 편평세포로 세포질이 적고, 혈관의 장축 방향으로 긴 타원형의 핵을 갖고 있다. 내피세포의 내강면은 평활하며, 세포의 외측면(線)에서 서로 견고하게 결합하고 있어 인접하는 세포는 서로 겹치는 부분을 볼 수가 있다.

Cell Applications, Inc 홈페이지 발췌

 

Endothelial Cell line 의 종류

  -  혈관으로부터 분리되어 세포주로 사용되고 있다.

    ; Large vessel (Aorta 대동맥, Artery 동맥, Vein 정맥)  / Small vessel (Capillary 모세혈관)

 

-  사람의 분리된 혈관 조직에 따른 세포주의 이름 및 약어 목록은 다음과 같으며, 혈관 세포주 또는 정상 세포주를 사용해야 하는 실험은 대부분 13. HuVEC 세포주를 주로 사용한다.

 

1. Human Aortic Endothelial Cells: HAOEC

2. Human Brachiocephalic Artery Endothelial Cells: HBcAEC

3. Human Carotid Artery Endothelial Cells: HCtAEC

4. Human Coronary Artery Endothelial Cells: HCAEC

5. Human Dermal Lymphatic Microvascular Endothelial Cells: HDLMVEC

6. Human Dermal Microvascular Endothelial Cells: CADMEC/HMVEC

7. Human Femoral Artery Endothelial Cells: HFAEC

8. Human Internal Thoracic Artery Endothelial Cells: HITAEC

9. Human Lung Microvascular Endothelial Cells: HLMVEC

10. Human Pulmonary Artery Endothelial Cells: HPAEC

11. Human Subclavian Artery Endothelial Cells: HScAEC

12. Human Umbilical Artery Endothelial Cells: HUAEC

13. Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVEC

 

Preparation of culture media (배양액의 준비)

- Media 의 종류

  ; 기본적으로 EBM (Gibco, #M-200-500 or M-200PRF-500 ) media 를 사용한다.

    추가해야 하는 최소 supplemented (Gibco, #S-003-10 or S-003-K)조성은 다음과 같다.

 

- Fetal bovine serum: 2% v/v

- Hydrocortisone: 1 µg/mL

- Human epidermal growth factor: 10 ng/mL

- Basic fibroblast growth factor: 3 ng/mL

- Heparin: 10 µg/mL

Gibco 홈페이지 발췌

 ; 본인은 주로 EGM-2 BulletKitTM (Lonza, #CC-3162) 을 사용하였으나, 최근에 다양한 제품이 나와 있으니 어느 회사의 제품을 사용해도 무방하다. Lonza 에서 판매하고 있는 media 종류를 간단히 소개하면 다음과 같다. 

• 1 x EBM-2 Basal Medium, 500 mL
• 1 x EGMTM-2 SingleQuotsTM Supplement Pack containing:

• 1 x Bottle FBS, 10.00 mL
• 1 x Natural Cap Vial with Hydrocortisone, 0.20 mL
• 1 x Gray Cap Vial with hFGF-B, 2.00 mL
• 1 x White Cap Vial with VEGF, 0.50 mL
• 1 x Yellow Cap Vial with R3-IGF-1, 0.50 mL
• 1 x Blue Cap Vial with Ascorbic Acid, 0.50 mL
• 1 x Green Cap Vial with hEGF, 0.50 mL
• 1 x Red Cap Vial with GA-1000, 0.50 mL
• 1 x Orange Cap Vial with Heparin, 0.50 mL

 

Lonza 홈페이지 발췌

• EGMTM BulletKitTM (CC-3124) – Optimized for HUVECs cat. no. CC-2517 and CC-2519, contains 2% FBS and BBE. Does not contain exogenous VEGF.
• EGMTM-Plus BulletKitTM (CC-5035) – Enhanced version of EGMTM Medium. Optimized for HUVECs cat. no. CC-2935. Contains 2% FBS and BBE. Does not contain exogenous VEGF. Faster proliferation than HUVECs isolated in EGMTM Medium.
• EGMTM-2 BulletKitTM (CC-3162) – Optimized for certain HUVECs, Aortic and Pulmonary artery endothelial cells. Contains 2% FBS and VEGF for rapid proliferation. Does not contain BBE.
• EGMTM-2 MV BulletKitTM (CC-3202) – Coronary and Iliac artery, human microvascular endothelial cells, contains 5% FBS and VEGF for rapid proliferation. Does not contain BBE.

 

Cell thawing

1. choose correct thbe from liquid nitrogen tank.
2. transfer to 37℃ water bath with a lid
3. 얼음이 하나 떠 있을 정도까지 녹으면 꺼내서 70% EtOH 로 washing
4. 1ml pipette 으로 conical tube 에 천천히 옮긴다.
5. (남은 residue로 viability test 시행)
6. prewarmed media 9ml를 천천히 계속 흔들면서 첨가한다. (한방울씩)
7. centrifuge at 1000-1500 rpm (400 x G) 4℃ for 5min
8. vacuum suction
9. resuspend cell pellet.
10. plate cells to new flask (P60 3개 또는 T75 or P100 1개)
11. change media immediately after attachment(next day)

 

Cell Culture

1. EC 는 최장 9일까지 배양이 가능.(5-7일째 subculture)
2. 이틀에 한번씩 media change. (오늘chage-->모레 chage)
3. 3세대에서 10세대까지 사용가능, 하지만 6세대까지 사용하는 것이 좋다.
4. cell의 특성상 쉽게 오염되거나 배양되지 않을수도 있음.
5. 실험군 외에 다음세대 subculture 용으로 flask 1~2개 정도 같이 배양.
6. P60 하나를 T75 3개정도로 subculture 할수있음.